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高效液相色谱(HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

作为实验室最常见的精密仪器之一，其使用频率较高，其已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

在这里，小编整理了高效液相色谱(HPLC)使用过程中常见的日常维护和保养方法，希望给用户的日常使用提供一定的参考价值。

流动相及样品的制备要求

• 高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤，且流动相需要定期更换；

• 流动相脱气至关重要(可采用抽滤，超声波脱气等方法)；

• 样品溶解后，用0.22微米的有机系膜或者水系膜过滤。

高压恒流泵的维护和保养

高压恒流泵为整个色谱系统提供稳定均衡的流动相流速，保证系统的稳定运行和系统的重现性。高压输液泵由步进电机和柱塞等组成，高压力长时间的运行回逐渐磨损泵的内部结构。在升高流速的时候应梯度升高，最好每次升高0.2mL/min，当压力稳定时再升高，如此反复直到升高到所需流速。

特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇或甲醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。在仪器使用完了以后，要及时清洗管路并冲洗泵，保证泵的良好运转环境，保证泵的正常使用寿命。

色谱柱的维护和保养

• 所使用的流动相均应为HPLC级或相当于该级别的，在配置过程中所有非HPLC级的试剂或溶液均经0.22um薄膜过滤，而且流动相使用前都经过超声仪超声脱气后才使用。

• 所使用的水必须是经过蒸馏纯化后再经过0.22um水膜过滤后使用，所有试液均现用现配；并且在进样的样品都必须经过0.22um薄膜针筒过滤后进样。

• 所使用到的最大流速为1.0mL/min，所以流速提升过程应是梯度提升，不存在流速的突升突降。

• 仪器检测完，需要用流动相梯度洗脱色谱柱1小时以上。

工作站的维护

出现死机可重启计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。

柱压问题

柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。

• 压力过高

这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高。

1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查：

(1)首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；

(2)打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；

(3)把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。问题无法解决可考虑更换色谱柱。

2、流速设定不正确：可重新设定正确流量。

3、流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。

4、系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。

• 压力过低

1、一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜。

2、泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。

3、无流动相流出：检查储液瓶中有无流动相，沉子是否浸在流动相中，泵是否运行。

4、参比阀未关闭：将流速降低后关闭参比阀。一般降至0.1～0.2mL/min后关闭参比阀。

基线问题

• 基线漂移

基线漂移是色谱工作者普遍遇到的问题，在实际工作中，我们经常能遇到基线漂移的情况，特别是在梯度洗脱的时候，基线漂移是常有的事。一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要30min的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：

1、柱温波动 控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。

2、流通池被污染或有气体 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(最好断开柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。

3、紫外灯能量不足：更换新的紫外灯。

4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。 检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。

• 基线噪音

对于紫外检测器，氘灯光源打开后要预热30min以上，基线才能稳定。噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化，分短期噪声和长期噪声两种。

氘灯用的过久，接近寿命期时(氘灯的寿命约1000h), 会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。除光源外, 流路中的气泡也会产生噪音。对于判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡的问题，可将泵关上，继续走基线，如果噪声立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪声来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出现，应考虑是灯的问题。

保留时间

保留时间的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是由于不同机理的色谱柱老化，如固定相流失(例如通过水解)，色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。保留时间漂移的几种最常见的原因和解决方法如下：

• 色谱柱平衡

如果观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已经平衡。在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上,从而造成保留时间的漂移。应注意:水是很容易污染的流动相成分。

• 固定相稳定性

固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的pH范围内使用,固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性最好，水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。

• 色谱柱污染

保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。

通常通过实验可判断污染的来源。样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质，如：配药中的赋形剂，生化样品(如血清)中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。

通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加，可以通过使用固相提取(SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响，避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。

通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解，DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。

• 流动相组成

流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等，应防止流动相由于蒸发、反应等等原因造成的变化。保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性。

峰型异常问题

峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。

• 色谱图中未出峰

系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。

• 一个峰或几个峰是负峰

流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

• 所有峰均为负峰

信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。

• 所有峰均为宽峰

系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。

• 所出峰比预想的小

样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

• 出现双峰或肩峰

进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

• 前伸峰

进样量或样品浓度高，溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

①柱温低：升高柱温；

②样品溶剂选择不恰当：使用流动相作为样品溶剂；

③样品过载：降低样品含量；

④色谱柱损坏：更换柱子。

• 拖尾峰

柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。

• 出现平头峰

检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

• 出现鬼峰

进样阀残余峰，可能为上次样品的残余。在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

• 峰分叉

①保护柱或分析柱污染：取下保护柱再进行分析,如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。

②样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。

• 峰变形

样品过载，减少样品载量。

1、早出的峰变形：样品溶剂选择不恰当

①减少进样体积；

②运用低极性样品溶剂。

2、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰：柱外效应

①调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)；

②使用小体积的流通池。

3、酸性或碱性化合物的峰拖尾：缓冲不合适

①使用浓度50～100 mM的缓冲液；

②使用Pka等于流动相pH值的缓冲液。

4、额外的峰

(1)样品中有其他组分：正常现象；

(2)前一次进样的洗脱峰：①增加运行时间或梯度斜率；②提高流速；

(3)空位或鬼峰：①检查流动相是否纯净；②使用流动相作为样品溶剂；③减少进样体积。