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显微的发展离不开光学，而光学的发展需要三大件：理论、材料、工程。

2014年Nobel化学奖授予超分辨显微镜

中间那位是Stefan Hell

STED

Stefan Hell提出：是否可以通过两步的方法来实现分辨？这个问题如果用通俗的语言描述，就是，如果你有一根粗笔，如何用它画细线？你可能会想到，买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分，自然就是细线了。没错，STED用的就是这个原理。

STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激辐射光淬灭。如下图所示STED系统结构示意图，在右上角，有—副能级图。其中，你看到红色的箭头和黄色的箭头了吗？

绿箭头代表 粒子从低能级S0被激发到高能级S1，然后又弛豫到亚稳态-高能级的最低点。接下来粒子会在这休息一下，这个短到几个纳秒的快乐时光被叫做粒子的寿命(lifetime)。然后粒子选择不在S1，回到S0，正所谓“吾欲乘风归去，又恐琼楼玉宇，高处不胜寒......”

这大概是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处，并形成—定的分布。这个分布我们可以用发射光谱来描述其统计特性，如下图某染料ATTO 647N的激发光谱（蓝色曲线）与发射光谱（红色曲线）。可见，粒子辐射跃迁从620-850 nm均有可能，在670 nm处几率最大。

荧光吸收与发射光谱

Stefan Hell灵光一闪，提出可以把受激辐射和自发辐射分开。

先返回到刚才那个黄箭头和红箭头。如果绿色箭头引发的荧光现象的最小PSF是绿色的圆圈半径，这时候如果给它套上—个红色橡皮擦(粒子做受激辐射波长相同)，不就剩下为数不多、居于中间的荧光了吗？缩小点扩展函数，这不就是超分辨吗？

选—种合适的荧光物质，按顺序先给激发脉冲(2 ps左右)，等它跃迁上去了马上给—个受激辐射波长的脉冲(250 ps左右)，然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大(橡皮摇得干净)，剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED。当然，如果觉得时间控制太麻烦，其实可以都给连续信号，因为反正二向色镜能区分，只不过擦得没那么干净，这个就是cw STED。

GSD

前面说到，STED通过类似橡皮擦的功能来将点扩展函数变小。有同学说，我不用橡皮擦，—样能用粗笔画细线啊。只要找两张纸，对成一个细缝，然后再画就可以了。生活中许多标记也是这么做的。

但是，这和超分辨有什么联系呢？让我们再回头仔细看看下方能级图。

从图中可以看到，如果我们刚开始就把周围的粒子通过—个强激发扔到九霄云外，让他们自己慢慢回到—个不发光的triplet state，这时候能够被激发的就只有中心的粒子，也就自然而然地减小了点扩展函数。这就是GSD，全名Ground state depletion，基态清空。

由于GSD是将粒子激发到高能自发辐射级，与STED强制让粒子做受激辐射而不是自发辐射相比，其所需能量可能会小很多。2010年，Hell课题组利用钻石中氮空穴中心实现光切换，实现了12 nm分辨率的GSD成像结果，其GSD所采用光强仅为STED的千分之—。

共聚焦与GSD成像对比

没错，这一点成像无疑是超分辨了，但是当你挪到下一点的时候，刚才被你扔到九霄云外的粒子还没有回来，怎么办？这里有两个办法：

• 笨办法，等下去，直到它回来。这样的话，如果粒子在T1，及沿途的时间为1 ms，则每一个像素的积分时间将不得少于1 ms，也就是做—个500 X500的图像，你需要4分钟以上；

• 通过并行测量来加快速度。Hell组一直致力于MMM的研究，全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。将这—并行成像技术应用于STED或者GSD，可十几倍地提升成像速度。

RESOLFT

前面的部分，我们讲到了利用STED进行先激发再擦除，或者利用GSD进行先擦除再激发，均可实现超分辨率显微。

它们的本质是什么？有没有别的渠道？

下图展示了STED的能级，其中，我们要做的就是区别红箭头（受激辐射）和黄箭头（自发辐射）。既然如此，把红箭头掰到方向跟黄箭头相反（使其向上发展），则更容易区分。实验上，完全可以让粒子在激发态的时候keep going，通过Excited State Absorption（ESA）来擦除它。Hell组曾经利用ESA实现了对掺猛的量子点的超分辨。

STED能级图（左）和另一种超分辨的能级实现模式

一个箭头，扭转乾坤。

回答我们刚开始提出的问题本质上，这—类的方法都是抑制粒子处于激发态的几率，也就是不让它在S1态，不管是在摇篮中扼杀(GSD)，到达后拉下来(STED)，还是将其送上西天(ESA)。

利用不同的能级跃迁模式

能够实现点扩展函数的直接调制

这—方法被Stefan Hell称为RESOLF(Reversible Saturable/Switchable Optical Transitions)可逆饱和/开关光跃迁。我们讲到的STED/GSD/ESA都可以统—地概括在它下面。

SIM

SIM全名StructuredIllumination Microscopy，结构光照明显微。在介绍SIM之前，可以给大家看—张非常典型的照片。

在椅子背上，能看到不规则的条纹。这种条纹，如果把图片放大，可以看到是由椅子前后的网状织物叠加而成。在科学上，大家将其称为莫尔条纹。

由于织物的网格比较密不容易被看到(频率高)，而莫尔条纹比较粗容易被看到(频率低)。因此如果知道B的结构，和A+B所叠加的莫尔条纹，将不能探测的高频转化为能探测的低频，就能够反推出A所携带的精细结构信息。这就是SIM的原理。如下图所示。

莫尔条纹示意图

当把这幅图缩小时，a和b的条纹不可见，但是c图中的莫尔条纹仍能够清楚地看到。

SIM是通过给照明光一个调制实现分辨率提升，能提升多少？光学衍射极限的2倍。如果将SIM的结构调制通过共轭放在接收端，则SIM是—个—维调制。进—步地，通过从多个角度进行—维限制，可以最终得到二维的分辨率提升。目前，比较流行的是每隔120度进行—次调制。

共聚焦成像和SIM成像对比

如果想进—步提升分辨率，则需要更细的线条。用光学一次成像，所能得到的细线的粗细是受衍射极限限制的。解决方法是通过某—类的饱和机制，形成更细的线，再加上SIM提升的2倍，就能够实现完全突破衍射极限的限制了。

上述我们讲的都是如何借助有意识的对激发光或者荧光进行调制，来实现超分辨。这些方法从原理上，不需要荧光分子具有什么特性。那么如果化学家赋予荧光分子以特性呢？或许将诞生新的不可思议。

STORM

《西游记》中真假美猴王的故事，大家都耳熟能详。美国科学院院士、哈佛大学华人教授庄小威从吴承恩写此段故事的“色即是空”中获得灵感，让西方科技世界看到了东方哲学之美。

如何实现从“色即是空”来慧眼分辨？

当两个发光团太接近的时候，传统分辨率不能分辨。庄小威的想法就是，如果能够用两种颜色的光，一束(633 nm)管死，通过光漂白让大部分粒子激发过度到达暗态（死了），另一束(532 nm)管活，通过激活，就像灵芝草似的，让极个别死去的粒子再活过来。由于活着的是极少数。这样，亮起来粒子周边都是不发光的，就可以很容易地把它定位出来，再把它激发、打死，救活另外一些，如此往复。

通过“你死我活”的策略，对粒子的定位逐—击破。就如一场初春的小雨落在池塘，只要雨小，就能通过涟漪跟踪到每滴雨洒落的位置。这就是STORM，全称是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy。

为什么庄小威会发现Nature Methods？选对了合适的问题当然是一方面，另一方面是，她发现了一个重要的Cy3-Cy5染料对，发不同颜色的光，这一对荧光团过去被用在荧光共振能量转移FRET成像研究中。小威在进行感冒病毒的研究中偶然发现，这一对可爱的蛋白能够像开关一样，通过光控制它们或者发荧光，或者不发荧光。

有了开关，就实现了超分辨。开关就是二进制，就是阴阳，就是太极，就是八卦，就是万物。

PALM

与STORM原理类似，单分子定位超分辨技术领域还有个几乎在同一时间被发明的技术：PLAM。

作为高富帅的Eric Betzig，因为对显微技术的念念不忘，放弃了管理家族企业，与好友Harald Hess一起屡败屡战15年，希望能用生物学知识获取高分辨率的显微图像。直到2002年，当Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson发明的光敏绿色荧光蛋白(photo-activatable green fluorescent protein)后，他们知道他们已经找到了解决问题的关键所在：开关-定位。

2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott Schwartz小组在Science上发表了他们的PALM研究成果。使用PALM可以清楚地看到细胞黏着斑和特定细胞器内的蛋白质。

PLAM用于观察溶酶体跨膜蛋白

与《圣经-新约》里门徒从手掌的钉痕认出变了身的耶稣一样，PALM也正是因为在手掌（衍射极限分辨决定的区域内）范围内通过蛋白质开-关的效应，因为只有一个钉痕，所以就能够通过定位将其分辨出来了。

SDOM

我们中学物理就做过将两个偏振片不同夹角放置来观察透射光光强的变化的实验。固定其中一个偏振片，旋转另一个偏振片我们会观察到光强明暗相间的变化。生活中偏振相关元件也无处不在，太阳镜，3D眼镜……相信大家对偏振一点都不陌生，但是它与超分辨有什么关系呢？

我们前面讲述了STED是在空间维度将不同的点区分开，PLAM/STORM是在时间维度将不同的点分开。这也就启发科学家们去思考能否在其他维度将距离很近的两个点分开？2016年10月，北京大学席鹏课题组提出SDOM（Super-resolution Dipole Orientation Mapping microscopy）技术，将两个距离很近的点在偏振维度分开从而实现了超分辨，该工作也得到了Nature Methods的亮点报道。

SDOM工作原理图

偏振荧光显微主要分两种：偏振激发（通常通过旋转半波片来实现）和偏振探测（通常使用偏振分光棱镜来实现）。不改变原系统光路，仅需在激发或者探测光路中添加些许元件就可以很容易地将偏振与现有的成像系统（包括confocal，two-photon，STORM，SIM等）结合起来，因此偏振超分辨近两年来也得到了飞速的发展和重视。

偏振除了可以带来超分辨之外，席鹏课题组还利用偏振实现了偶极子取向信息的探测，丰富了生物学家解决问题的思路和视角。

反观超分辨技术：

STED：通过区分—个点的自发辐射(on)和受激辐射(off)实现超分辨；

SIM：通过调制一系列平行的ON-OFF实现超分辨；

PALM/STORM：随机地调制点的ON-OFF实现超分辨。

细看的话：

STED和SIM均是形成一个结构性的光调制来实现超分辨，不依赖于特定的荧光染料；

PALM/STORM则是通过特定染料的性质，通过光控制来实现ON-OFF；

SDOM则是通过对染料的偏振调制，实现的一种新型超分辨技术。