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高效液相色谱法是什么？

高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。

通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论；在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达29.4MPa)；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

高效液相色谱的特点

• 高压

液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

• 高速

流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1-10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。

• 高效

HPLC的分离效率高于普通液相色谱，在发展过程中又出现了许多新型固定相，使分离效率大大提高。

• 高灵敏度

高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般微升。

• 适应范围宽

气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75%-80%)原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70%-80%。

高效液相色谱的组成

由溶剂输送系统(脱气机、高压泵等)、进样系统(定量泵、六通阀、定量环、进样针等)、分离系统(色谱柱等)、检测系统(检测器等)、记录及数据处理系统组成。

• 高压输液系统

将流动相在高压下连续不断地送入液路系统，具有足够的压力，输出流量恒定、可调，输出压力平稳，泵室体积小，泵体抗腐蚀、耐酸等特点。

压力平稳、流速恒定是系统稳定、重现性良好的前提条件，多数的HPLC故障、色谱数据异常均会表现出压力异常，如偏高、偏低、波动大等，在日常使用中需特别关注压力变化。

• 在线脱气机

四元低压系统属于泵前混合，由于在常压下混合，易产生气泡，必须配有在线脱气机，并要求流动相使用前进行脱气。

流动相脱气方法有低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。

流动相脱气目的：

• 使色谱泵输液均匀准确，减小脉动；

• 提高保留时间和色谱峰面积的重现性；

• 防止气泡引起尖峰；

• 使基线稳定，提高信噪比；

• 降低溶剂的紫外吸收本底；

• 减少死体积；

• 防止填料氧化。

• 进样系统

(1)手动进样系统

定量环用于准确定量，分为5μl、10μl、20μl等，需要根据不同进样量选择合适的定量环。

(2)自动进样系统

仪器自带定量环多为100μl，如进样量大于定量环体积需咨询相应仪器工程师更换定量环及计量泵等，六通阀是理想的进样部件，其由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成，通过阀切换保证恒定的流速。

分析液相多数配自动进样系统，因其具有进样精度高、重现性好、可用于大量样品分析等特点；也要求具有良好的密封性，小的死体积，好的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。

• 分离系统

包括色谱注、柱温箱、连接管线等部件。

(1)色谱柱

色谱柱是实现分离的核心部件，由柱管和固定相组成。柱管为直型不锈钢管，一般色谱柱长5-30cm，内径4-5mm，凝胶色谱柱内径3-12mm，而制备色谱柱内径则可达25mm。一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前，先通过前置柱。HPLC柱的填料颗粒粒径一般约为3-10m，填充常采用匀浆法，色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，根据不同的实验需求需要选择不同填料、不同规格的色谱柱。

(2)柱温箱

保证分离系统的温度恒定，降低温度波动对色谱基线、保留时间及色谱分离的影响，包括普通柱温箱及带有冷却功能的柱温箱，普通柱温箱可根据方法需求设定高于室温的温度(一般应高于室温5℃以上)，降低柱压或是改善色谱分离，带有冷却功能的柱温箱可以升高柱温外，还可以设定低于室温的温度，预防稳定性差样品的降解，各品牌柱温箱的控温范围略有差别，需要通过相应产品说明书或咨询了解。需注意：有些品牌的柱温箱是没有配置预加热模块的，对于温度敏感的样品需要在柱前连接一段管线，对流动相进行预加热，管线长度及内径需适当，尽量降低死体积。

• 检测系统

用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置，包括紫外可见吸收检测器(UVD)、荧光检测器(FD)、蒸发光检测器(ELSD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ED)、化学发光检测器(CD)、质谱检测器(MS)等类型，其技术要求为灵敏度高、噪音低、线形范围宽、响应快。

(1)紫外可见吸收检测器(UVD)

波长范围190-800mm，190-400mm为紫外区域，氘灯；400-800mm为可见光区域，钨灯。其特点为灵敏度高，最小检测浓度10-9g/ml，线性范围宽，对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱，应用范围广。适用于带有共轭基团的化合物，为最常用的检测器。

(2)荧光检测器(FD)

氘灯作激发光源，波长范围250-600nm。其特点为灵敏度更高，检测限10-12～10-13g/ml(灵敏度比UV检测器高2-3个数量级)，选择性好，对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱，所需试样量少，适于痕量分析，应用于组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。

(3)蒸发光检测器(ELSD)

一种通用型检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。其主要缺点为响应值与浓度不呈线性，需取响应值的对数与浓度计算线性。

(4)示差折光检测器(RID)

一种连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的通用型检测器，其优点为对糖类检测灵敏度较高，其检测限可达10-8g/ml；稳定性好，操作方便，缺点该检测器对多数物质的灵敏度低(约10-5g/ml)，通常不用于痕量分析；受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱。

(5)质谱检测器(MS)

将样品中的分析物电离，不同质量离子在电场或磁场中，将按其质量和所带的电荷比(质荷比，m/z)进行的分离和排序，根据质荷比的大小和相对强度形成规则的质谱，从而对物质进行结构鉴别和定量分析。质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，但流动相中不能含有无机盐。

气相色谱法的核心知识点

• 高效液相色谱法对流动相的要求

流动相不与色谱柱发生不可逆化学变化，以保持柱效或柱子的保留性质较长时间不变；对待测样品有足够的溶解能力，与所用检测器相匹配；粘度尽可能小，以获得较高的柱效；流动相纯度要高，价格便宜，毒性小。

• 高效液相色谱法按固定相承受压力分类

(1)刚性固体

以二氧化硅为基质，可承受较高压力，表面可键合各种功能官能团——键合固定相，是目前应用广泛的固定相。

(2)硬胶

主要用于离子交换色谱法和凝胶色谱法中，由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，可承受的压力较低。按孔隙深度分：

①表面多孔型

基体是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一层多孔活性物质如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂、分子筛等。适用于快速分离、填充均匀紧密、机械强度高、能承受高压，适于简单的样品及常规分析；缺点是多孔层薄，进样量受限制。

②全多孔型

由硅胶颗粒聚集而成，比表面积大，柱容量大，小颗粒全孔型固定相孔洞浅传质速率快，柱效高，分离效果好，适合于复杂样品、痕量组分的分离分析，是目前HPLC中应用广泛的固定相。

• 液固吸附色谱法原理

以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，试样分子被流动相带入柱内时，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附。分离过程是一个吸附-解吸的平衡过程。

• 液固吸附色谱法固定相

通常是硅胶、氧化铝、活性炭等固体吸附剂，硅胶最常用；流动相：极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。应用：几何异构体分离和族分离，如农药异构体；石油中烷、烯、芳烃的分离。不适于强极性的离子型样品的分离，不适于分离同系物(因为，它对相对分子质量的选择性较小)。

• 液液分配色谱法原理

根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同实现分离，分配系数较大的组分保留值也较大。

• 液液分配色谱法流动相

流动相与固定液应尽量不互溶，或者二者的极性相差越大越好。根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱(流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于强极性和中等极性组分分离)和反相分配色谱(流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性或弱极性组分分离)。固定相：由载体和固定液组成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鲨烷等。应用：同系物组分的分离。例如分离水解蛋白质所生成的各种氨基酸，分离脂肪酸同系物等。

• 化学键合固定相

化学键合固定相是利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。

• 化学键合固定相的特点

固定相不易流失，柱的稳定性和寿命较高；能耐受各种溶剂，可用于梯度洗脱；表面较为均一。没有液坑，传质快，柱效高；能键合不同基团以改变其选择性。例如键合氰基、氨基等极性集团用于正相色谱法，键合离子交换基团用于离子色谱法，键合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非极性基团用于反相色谱法等。因此它是HPLC较为理想的固定相。

• 离子交换色谱法原理

离子交换色谱法的固定相是离子交换树脂，流动相是水溶液，它是利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离的。

• 离子交换色谱法流动相

水的缓冲溶液，阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。

• 凝胶色谱法原理

凝胶色谱法的固定相为多孔性凝胶类物质，流动相为水溶液或有机溶剂，它是根据不同组分分子体积的大小进行分离的。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。

• 凝胶色谱法流动相

能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶并防止吸附作用)、粘度小(增加扩散速度)。常用四氢呋喃、苯、氯仿、水等。

• 影响分离的因素与提高柱效的途径

(1)液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍左右，故降低传质阻力是提高柱效主要途径；

(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效；

(3)液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；

(4)恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素；

(5)流速大于0.5cm/s时，H-u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数；

(6)气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。