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高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

作为分析化学中被广泛使用的一种技术，高效液相色谱法用于分离、鉴定和量化混合物中的成分。高效液相色谱分离的成功与否在很大程度上取决于流动相的特性，流动相是流经固定相的液体溶剂。应根据分析物的化学性质和所用固定相的性质仔细选择流动相。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

什么是流动相？

流动相是流经高效液相色谱柱固定相的液体溶剂，携带着分析物。其两个主要作用如下：

• 溶解样品成分并将其带入固定相；

• 与固定相相互作用，促进分析物的分离。

流动相的类型

高效液相色谱法使用的流动相可分为两大类：

• 水性流动相(主要成分是水)

高效液相色谱分离通常使用水性流动相，因为水性流动相能有效溶解多种分析物，而且价格通常低于非水性溶剂。常见的水性流动相是水与甲醇或乙腈等有机试剂的混合物。有机改性剂的选择取决于所分离分析物的性质和所使用的固定相。

• 非水性流动相(不含水)

当被分离的分析物不溶于水或水会干扰分离时，就会使用非水性流动相。非水性流动相包括二氯甲烷、四氢呋喃和正己烷等溶剂。这些溶剂通常与甲醇或乙腈等极性溶剂结合使用，以提高分离效率。

流动相的特性

流动相的特性对高效液相色谱分离至关重要，因为它们会大大影响分离效率和选择性。其重要特性包括极性、粘度、pH值和离子强度。

• 极性

流动相的极性是高效液相色谱分离的关键因素，因为它决定了分析物与固定相之间相互作用的强度。极性流动相适用于分离极性化合物，而非极性流动相则是分离非极性化合物的理想选择。可通过改变水性流动相中有机改性剂与水的比例来调节流动相的极性。

• 粘度

粘度是流动相的另一个关键属性，因为它会影响流动相通过色谱柱所需的流速和压力。流动相的粘度可通过改变溶剂成分、温度或压力来调节。

• pH

流动相的pH值在高效液相色谱分离中非常重要，因为它会影响分析物和固定相的电离状态。流动相的pH值应根据被分离分析物和所用固定相的pKa值进行调节。如碱性流动相适合分离酸性化合物，而酸性流动相则适合分离碱性化合物。

• 离子强度

流动相的离子强度是指溶液中离子的浓度，它通过改变分析物与固定相之间的静电相互作用来影响分离效率。流动相的离子强度可通过改变溶液中盐或缓冲液的浓度来调节。

流动相相当于液相的血液，在使用过程中会有各种需要注意的事项。其中有些“坑”千万要注意！

1、加入有机溶剂之后测量移动相酸碱度

如果用有机添加剂测量pH值，得到的pH值会与添加有机溶剂之前的值不同。然而最重要的一点是要保持一致。如果总是在加入有机溶剂之后测量pH值，那么务必保证在使用的方法中陈述步骤，这样的话其他人就会按照统一方式进行。这种方式并不保证百分百准确，但至少可以保持方法的前后统一。这也许会比得到精准的pH值更加重要。

2、没有使用缓冲液

缓冲剂的作用就是用来控制PH值并阻止其发生变化。很多其他方法会改变流动相的PH值，会引起停留时间、峰形以及峰值响应的漂移。甲酸、TFA等不是缓冲剂。

3、没有在正常酸碱度范围内使用缓冲液

每个缓冲盐有两个pH单位范围宽度，在这个范围内可以提供稳定性好的pH值。窗口之外的缓冲盐不具备有效的抗pH值变化能力。要么在正确的范围内使用缓冲剂，要么选择一种缓冲剂可涵盖所需pH值。

4、向有机溶液中加缓冲液

将缓冲溶液与有机相混合，很有可能会引起缓冲液沉淀。在很多情况下，即使沉淀现象已经发生了，但仍很难被发现。切记，一定要将有机溶液加入到水相当中，这可以很好的降低缓冲液沉淀的几率。

5、从0%用泵混合浓度梯度

现在使用的泵可有效的混合流动相并实现在线脱气，但并不是使用同一方法的任何人都会配有高质量的泵。将A和B混合到一个单独的溶液中，在100%线上运行。如通过用50ml水混合制备有机950ml起始混合物。这样做的好处就是可以减少HPLC之间的可变性，减少系统中产生气泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶体的预混合保留时间也为95:5。

6、不要使用正确的改性酸(碱)改变缓冲液

只能使用形成你使用的缓冲盐的酸或碱。如磷酸钠缓冲液应仅用磷酸或氢氧化钠调节。

7、没有在方法中阐述有关缓冲液的全部信息，如在1000ml的水中加入5g磷酸钠

缓冲剂的类型决定了能够缓冲的PH范围。所需的浓度决定了缓冲强度。5克或无水磷酸钠和5克一水合物磷酸一钠具有不同的缓冲强度。

8、还没先检查就开始添加有机溶剂

如果上一个方法中基线B中使用过的是缓冲液，而你的方法中，基线B使用的是有机溶液，好在你可以沉淀泵管和泵头中的缓冲剂。

9、支起瓶体清空最后一滴

很有可能没有足够的流动相完成整个操作，最后样品会冒烟的。除了可能存在烧干泵系统和柱子的可能性之外，流动相也会蒸发的一干二净，瓶体顶部的流动相会发生变化。

10、利用超声脱气的流动相

最重要的一点就是确保所有的缓冲盐已经溶解，但这是一种效果差的脱气方式，并且它会很快让流动相升温，从而引起有机成分蒸发掉。为了省去之后不必要的麻烦，请用五分钟时间使用真空过滤你的流动相。

11、选择流动相应注意过滤溶剂

溶剂在使用前一定要用0.5pm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。

12、注意保持储液瓶的清洁

用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。

13、注意保证溶剂的质量

一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。

14、注意流动相脱气不充分

流动相受热或流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：

(1)流动相再脱气；

(2)采用更有效的因脱气方法或两种方法配合使用；

(3)改系统内混合为系统外预混合。

HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。

• 系统中气泡的产生

流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡；

(1)气泡的影响

存在于管路中，系统压力不稳定，实验结果有偏差；存在于单向阀中，易造成液体回流，流量不准确，甚至是不吸液存在于检测器中，出现鬼峰，影响检测准确性。所以做液相对流动相的气泡和杂质要求比较严格。气泡会影响柱的分离效率，检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。噪声增大、基线不稳、突然跳动。

此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相(如烷基胺)反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。溶解氧能与某些溶剂(如甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收(特别是在260nm以下)，并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰)。

在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中(特别是还原电化学法)，氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV因检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。

(2)常用的脱气方法

加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。

a.氦气脱气

氦气脱气是很有效的脱气方法。氦气缓缓的通过流动相赶去溶入的空气，如果使用得当，在10min内可除去80%-90%的溶入气体。由于氦气在流动相中的溶解度极低，所以用氦气脱气保护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。其缺点是氦气价格比较昂贵，会增加检验成本。一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。

b.真空脱气

也是比较常用的脱气方法。现在多数企业都最常用这种办法，贮液器被抽成部分真空，溶入的气体蒸发形成气泡溢出，其效果仅次于氦气脱气。在线脱气只适合脱完气之后的流动相，在使用过程中的微量脱气。

c.超声波脱气

将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以目前仍广泛采用。这种方法只能除去30%的溶解气体，有时还会引起气体溶解度的增加。对氧敏感的检测器不宜用此法。超声脱气比较好，10-20分的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了(一般500ml溶液需超声20-30min方可)，关于超声时间问题众说纷纭，各实验室5-30分钟不等，一般来说流动相组成为无机(缓冲盐溶液)时，5-15分钟即可，流动相为是水和有机容积混合时，超声时间要相对长一些，时间的延长不和效果成正比，且其中气泡对色谱峰基线稳定性与信噪比有一定影响，一般来说影响不大，15min超声即可足够。此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

d.加热回流脱气

该法虽效果很好，但适用范围较窄。对于有机溶剂或混合流动相不适合用此法，因为挥发性组分会损失掉，改变流动相的组成。综合来说，用真空抽滤后，再用超声脱气是常用的办法，用氦气的方法是效果好的办法，而在线脱气本身也是真空脱气，但它可放到仪器上使用，是一种保证性的办法。

首先离线(系统外)脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1-4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。而在线(系统内)脱气法无此缺点。常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出来。此外还有在线脱气机。

15、注意流动相供给不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。

过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需查流动相的制备过程或换大孔径的过滤器。不管如何流动相都需要重新过滤。流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常会出现这种现象。使用以下方法解决：

• 使用低流速；

• 换大孔径的过滤器；

• 增加进液管道内径；

• 抬高或加压储液器；

• 不用过滤器，但流动相一定要先过滤；

• 储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；

• 进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。

16、注意防止流动相和储液器被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。流动相污染来自这几个方面：

• 试剂质量不高，玻璃器皿不合格；

• 微生物的影响；配制流动相时操作不当等，因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。要注意玻璃器皿按规定清洗干净；

• 为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统；

• 怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗即可(注意不要损坏柱和管道系统)；

• 真空脱气时防止泵油带入流动相；

• 用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相；

• 已经污染的流动相一定要废弃掉。

17、注意选择流动相应不改变填料的任何性质

低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

18、选择流动相应注意纯度

色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。

19、选择流动相应注意必须与检测器匹配

使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。

20、选择流动相应注意粘度要低(应<2cp)

高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长，最好选择沸点在100℃以下的流动相。

21、选择流动相应注意对样品的溶解度要适宜

如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。

22、选择流动相应注意样品易于回收

应选用挥发性溶剂。

23、选择流动相应注意由强到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

24、选择流动相应注意三倍规则

每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

25、选择流动相应注意粗调转微调

当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

26、流动相的配制注意有机溶剂和水性溶剂的混合方法

有机溶剂和水性溶剂的混合液作为流动相是经常的，但由于混合方法不同，有时分析结果相差很大。如20mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%的混合液，混合比为9：1时，20mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%的体积比为9：1，也就是可以解释为各自按体积比例的相当量称取后进行混合。另外，按10%乙腈解释，用20mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)，将乙腈稀释调制也可以成立。在后者情况下，产生混合体积减少部分，余下的添加20mM磷酸钠缓冲液。两者虽然没有太大的差别，但由于混合方式不同，分析结果特别是保留时间也会有大差别，这点必须注意。

27、50%或(V/V=1/1)乙腈水溶液的配制方法

对于用V/V=1/1的表示配制乙腈水溶液，多按这种方法进行：用量筒测定乙腈500mL，用另一量筒测定水500mL，两种液体在瓶内充分摇晃混合。不过50%乙腈水溶液的表示时，同样也多是按上述方法配制，但查化学辞典时，实际上是按这种方法进行配制：首先将500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶边搅拌边加水，等待液温达到室温，用全量水，使溶液到1L。这样一来，用%表示和“V/V"体积比表示，最终得出的流动相组成不同。也就是说，混合溶剂的密度，与由原溶剂密度计算的单纯平均值不相同，所以用上述两种方法调制的流动相组成差异。如在室温(25℃)附近水50mL和乙腈50mL混合时体积不是100mL，而有所减少，约为96mL。在一般情况下，多用操作简便的第一种方法。

28、流动相的配制注意溶剂体积的温度影响

溶液的密度受周围温度的影响。刚从溶剂冷藏箱拿出来的溶液温度与实验室的室温相比，要低不少，乙腈和水混合液因发热反应，溶液温度升高。因此为能调制再现性好的流动相，建议在使用前用恒温水浴锅将液温调到接近室温。

29、流动相的配制注意用两台泵进行溶剂混合

双泵主要是在探讨流动相的配比或者梯度洗脱是比较方便，知道确切的液相色谱仪条件时，建议配好后使用的话，混合比较均匀效果较好。在反相分析中，常用的有机溶剂和水的等浓度法，使用高压两元梯度系统，用两台泵将流动相分别输液后混合等封闭式混合时与预先在瓶内混合后用1台泵输液时，因混合后体积变化的不同，保留时间也有所不同，一定要注意。不仅是流动性的调制方法，试样溶液和其他溶液的调制也经常有上述问题。在这种情况下，就要求各部门在制作相关溶液配制方法时能规定通则，定义设计溶液的调制方法，这样避免混乱，以在日常工作中更好地记住这些表示方法。

30、注意流动相的pH

如需在一定PH值下操作，须定期测定流动相的PH值，大气中的CO2溶解在流动相内将引起PH值的改变，特别是贮液瓶密闭不严时这种影响可能更大。

31、注意更换柱子及流动相

软质或半软质填料的溶胀率随溶剂极性的变化而变化，使用新柱时应先用25-30倍柱容积的合适流动相平衡。更换流动相时，如果两种流动相不互溶，需采用过渡溶剂使前一种流动相逐步溶解除去。如2、2、4-三甲基戊烷换成甲醇时，必须用乙酸已酯或其他溶剂过渡，直到标准物保留值达到稳定状态。