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液相色谱仪根据固定相是液体或是固体，又分为液-液色谱(LLC)及液-固色谱(LSC)。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较，具有高效、快速、灵敏等特点。对高沸点、难气化合物的混合物通过色谱柱和淋洗剂并以实现分离。应用于生物化学、生物医学、环境化学、石油化工等部门。

工作原理

系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。

• 进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

• 输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。

• 分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10-50cm(需要两根连用时，可在二者之间加一连接管)，内径为2-5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5-10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成)，固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000)和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)，或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床易达到均匀、致密状态，易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

• 检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；灵敏度高(检测下限为10-10g/ml)；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml)，流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定，其灵敏度很高(检测下限为10-12～10-14g/ml)，痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

• 数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

应用

高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离HPLC成为解决生化分析问题理想的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。

高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等；液相色谱-红外光谱连用也发展很快如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。

流动相流速选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。

对于一根特定的色谱柱，要追求理想柱效，那就使用理想流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用理想流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

滤膜选择

1、常见滤膜

水系过滤膜，一般用于纯水相的过滤。在过滤含有机相的混合溶剂时应尽量避免使用水系滤膜，以防滤膜被溶解，因为水系滤膜一般由醋酸纤维素类的材料制成，耐有机溶剂性能较差。

有机系滤膜，本身也能过滤水，但水比较难浸润有机系滤膜，有些有机滤膜在水中超声几分钟使其浸润，或用有机溶剂润湿后也可以用于水系溶剂过滤。可以当然也可以先过滤甲醇再过滤水。混合系滤膜也可以用于水系溶剂过滤。但是，水系滤膜相对经济。

油系溶剂，采用专用的油系过滤膜，用于有机溶剂的过滤。混合系滤膜也可以用于有机溶剂过滤。

另外，如果该用有机相的滤膜，用了水的滤膜，滤膜会被溶解掉，导致管路堵塞。如果该用水的滤膜，用了有机相的滤膜，则流动相很难流下去。

2、微孔过滤膜

再生纤维素膜(Regenerated Cellulose Membranes，RC)为疏水型滤膜，具有非特异性吸附低，特别适合于除微粒过滤，其化学兼容性强，可以耐受大多数有机溶剂，其化学兼容性如下表所示。直径50mm和47mm，孔径0.45µm作为标准用于溶剂的超净和脱气过滤以及HPLC 流动相的过滤。主要用于有机溶剂的过滤。

醋酸纤维素膜(Cellulose Acetate Membranes，CA)具有理想流速和热稳定性以及低吸附。0.2µm的滤膜适合于水溶液、缓冲液、血清和培养基的除菌过滤。0.45µm的滤膜适合于HPLC的流动相过滤。关于得到膜吸附的公开结果是比较困难的，其与过滤的物质、过滤的条件和采用的测定方法以及被测定的膜没有被预先除菌有关。主要用于水相溶液的过滤。

硝酸纤维素(Cellulose Nitrate Membranes，CN)是理想的滤膜材料，其能提供非常一致的孔径结构和宽的孔径规格。大的孔径(8µm，5µm和3µm)用于趋药性和细胞截留，0.45µm用于微粒收集，小孔径(0.1µm)用于溶液的超净过滤和光散射测量。这种类型滤膜所具有的非特异性吸附性能使其利于许多印迹处理过程和诊断试剂的应用。用于样品预处理，颗粒检测或除颗粒。

聚四氟乙烯膜(PTFE Membranes，PTFE)采用PTFE材质，即使在很低的压差下，也能保证潮湿空气或其它气体通行无阻，而水溶液则不能透过。其性能与亲水膜正好相反。PTFE滤膜具有强化学兼容性，能胜任所有的有机溶剂和强腐蚀化学品的过滤。在必须用PTFE滤膜过滤水相溶液时，须先用乙醇或异丙醇预浸润后，水相溶液才能滤过。用于空气、气体和疏水性化学品的过滤。

玻璃纤维滤膜(Glass Fiber Filters，GF)属于深层过滤，其主要用途是作为于过滤层，直接加在过滤膜上使用。注意，不同尺寸的滤器对预过滤膜的直径都有具体的要求，直径过大时，其边缘会伸到密封圈下引起漏液。用于提高过滤通过率和连续过滤。

尼龙膜(Polyamide Membranes，Nylon)具有理想机械强度，吸附性强，能耐受大多数有机溶剂和多数碱性溶液，适合于碱性溶液的过滤。用于有机溶剂过滤，如HPLC流动相除颗粒过滤时，尼龙膜比PTFE膜更经济实用，另外，尼龙膜还可作为转印膜。由于尼龙膜的吸附性能相对较高，一般不推荐用于培养基过滤或蛋白液等生物样品的过滤，以免因吸附而损失样品。在这种情况下，通常采用低吸附的醋酸纤维素膜(CA)，更为适用。用于碱性溶液和有机溶剂过滤。

使用注意要点

1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)；

2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用；

3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液；

4、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上；

5、长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉；

6、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器；

7、C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品；

8、堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗；②放在异丙醇中间用超声波清洗；③用10％稀硝酸清洗；

9、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡；

10、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液，通常在输液前要进行流动相的清洗；

11、要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品；

12、更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

常见故障的断定及解决

1、保留时间变化

• 柱温变化，柱恒温，必要时需配置恒温箱；

• 等度与梯度间未能充分平衡，至少用10倍柱体积的流动相平衡柱；

• 缓冲液容量不够用，25mmol/L的缓冲液；

• 柱污染，每天冲洗柱；

• 柱内条件变化，稳定进样条件，调节流动相；

• 柱快达到寿命，采用保护柱。

2、保留时间缩短

• 流速增加，检查泵，重新设定流速；

• 样品超载，降低样品量；

• 键合相流失，流动相PH值保持在3-7.5检查柱的方向；

• 流动相组成变化，防止流动相蒸发或沉淀；

• 温度增加，柱恒温。

3、保留时间延长

• 流速下降，管路泄漏，更换泵密封圈，排除泵内气泡

• 硅胶柱上活性点变化，用流动相改性剂，如加三乙胺，或采用碱至钝化柱

• 键合相流失，流动相PH值保持在3-7.5检查柱的方向；

• 流动相组成变化，防止流动相蒸发或沉淀；

• 温度降低，柱恒温。

4、出现肩峰或分*

• 样品体积过大，用流动相配样，总的样品体积小于*峰的15%；

• 样品溶剂过强，采用较弱的样品溶剂；

• 柱塌陷或形成短路通道，更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件；

• 柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢，加在线过滤器，过滤样品；

• 进样器损坏，更换进样器转子。

5、鬼峰

• 进样阀残余峰，每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗；

• 样品中未知物，处理样品；

• 柱未平衡，重新平衡柱，用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)；

• (TFA)氧化(肽谱)每天新配，用抗氧化剂；

• 水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水。

6、基线噪声

• 气泡(尖锐峰)，流动相脱气，加柱后背压；

• 污染(随机噪声)，清洗柱，净化样品，用HPLC级试剂；

• 检测器灯连续噪声，更换氘灯；

• 电干扰(偶然噪声)，采用稳压电源，检查干扰的来源(如水浴等)；

• 检测器中有气泡，流动相脱气，加柱后背压。

7、峰拖尾

• 柱超载，降低样品量，增加柱直径采用高容量的固定相；

• 峰干扰，清洁样品，调整流动相；

• 硅羟基作用，加三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值，钝化样品；

• 柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢，加在线过滤器，过滤样品；

• 柱塌陷或形成短路通道，更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件；

• 死体积或柱外体积过大，连接点降至理想低，对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管；

• 柱效下降，用较低腐蚀条件，更换柱，采用保护柱。

8、峰展宽

• 进样体积过大，用流动相配样，总的样品体积小于*峰的15%；

• 在进样阀中造成峰扩展，进样前后排出气泡以降低扩散；

• 数据系统采样速率太慢，设定速率应是每峰大于10点；

• 检测器时间常数过大，设定时间常数为感兴趣*峰半宽的10%；

• 流动相粘度过高，增加柱温，采用低粘度流动相；

• 检测池体积过大，用小体积池，卸下热交换器；

• 保留时间过长，等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱；

• 柱外体积过大，将连接管径和连接管长度降小；

• 样品过载，进小浓度小体积样品。