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起源于上世纪60年代末的高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，建立在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，开始了高压泵、高效固定相、高灵敏度检测器各技术不断进步的旅程。其以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

解析真实世界的奥秘几乎都要用到分离技术，有机物构成了物质世界的绝大部分，而超过80%的有机物，大都采用HPLC进行分离和分析。因此，液相色谱构成了科学仪器领域极大的单品类，其市场之大让许多企业魂牵梦萦，无数企业前赴后继地进入液相色谱市场。

诞生与发展

1903年，俄国植物学家Tswett在会议上报道了应用吸附原理分离植物色素的新方法（后来文献发表于1906年），Tswett将这种方法命名为色谱（Chromatography），管内填充物被称之为固定相，冲洗剂被称之为流动相。

1941年，Martin等采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，与Synge一同提出著名的色谱塔板理论，两人获得了1952年的Nobel奖。液固色谱被创立后的50多年时间里，液固色谱装置并无实质性的改进；直到20世纪60年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，人们把气相色谱中获得的系统理论与实践经验应用于液相色谱研究。

1966年，耶鲁大学的Horvath首次提出高效液相色谱（HPLC）这个名称，后于1967年开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了HPLC的时代。1972-1974年，6000 psi泵、10µm粒径色谱柱和无隔垫进样器的引入，标志着HPLC从“高压”向“高效”的转变。液相色谱与光学检测器相结合，也使HPLC不仅可分离，还可同时完成分析任务，成就一套分离分析系统。

1973年，第一届HPLC会议在瑞士因特拉肯举行，1982年后每年举办。20世纪70年代末至80年代初，HPLC开发了分离肽和蛋白质的方法，为今日蛋白质组学和生物制药分析奠定了基础。

1979年至80年代初，开发了用HPLC分离对映体的方法，最初采用在流动相中加入修饰剂，后来开发了可分离对映体的固定相。20世纪80年代中后期，John Fenn开发了ESI离子源，成功用于LC-MS。

2004年前后，引入< 2µm粒径的新系统，推动耐压15,000-20,000psi的UHPLC的出现。

商用发展史

1、色谱柱技术

色谱柱技术是仪器开发的主要驱动因素之一。

1967年，耶鲁大学的Csaba Horváth和同事们在薄层填料（现称为表面多孔填料，SPP）方面的工作代表了HPLC柱和仪器技术的突破。50微米的球形玻璃珠涂有一层薄薄的聚苯乙烯树脂聚合物层（1-3μm），衍生形成阴离子交换功能，并用于分离核苷酸。颗粒被装入不锈钢柱（内径1mm，长度3米），这会产生高背压，需要使用泵将溶剂推过柱。这代表一个开始的趋势，即较小的颗粒会提高柱效，以提供更好的分离性能，同时也会增加柱背压，使其与平均颗粒直径成反比；因此，在接下来的几年里，泵输出压力将成为一个重要因素。除此之外，流速、额外柱效应（系统死体积）、峰宽减小、洗脱速度、样品通量和检测器能力等参数都成为改善HPLC系统所有部分的驱动因素。

2、第一台HPLC的诞生

经过色谱柱技术的发展，他们自制了梯度洗脱系统，使用两台 Milton Roy 微型泵。梯度由一个含有弱溶剂的搅拌储液池开始形成；然后由一个泵向该储液池输送受控但不断增加的强溶剂量；第二台高压泵将越来越浓的溶剂混合物从储液池推到色谱柱上；用一个带有8μL流动池的改良分光光度计检测。

1967年，他们与Picker Nuclear公司合作，推出第一台商用HPLC：LCS-1000。一个高压泵（高达4000psi）、一个进样Loop阀、一个柱温箱、装有上述薄层填料的色谱柱，以及一个基于低压汞蒸气灯的固定波长检测器（254 nm）成就了LCS-1000。1968年，该技术被Varian 公司收购（Varian后被安捷伦收购）。

同年，Waters推出首台HPLC系统ALC-100（ALC是分析液相色谱仪的首字母缩写），它改进了原有GPC-100系统，减少死体积，采用更高压力的Milton Roy泵，流通紫外检测器和（可选）和折射率（RI）检测器。Waters将其品牌口号“Ther Liquid Chromatography People“注册成商标，成为了LC的代名词。1972年，在Robert B.Woodward 及其博士后Helmut Hamberger的指引下，分离维生素B-12合成过程中中间体的异构体；从此HPLC打开了有机合成的市场。

色谱学家倾向于将HPLC的起源推至更早期的1964年。

杜邦公司的Jack Kirkland在参观Eidhoven理工大学时，在一间实验室里看到Josef F. K. Huber已在自制粗糙的HPLC仪器，带有紫外检测器，在GC颗粒上包裹液体（和流动相不混溶）后填充了色谱柱。参观后，Kirkland说服杜邦公司的经理让他研制HPLC，进行GC无法全部胜任的农药分离。

到1969年，杜邦公司推出820型集成色谱仪，有一个恒压泵、一个自制的UV 254 nm检测器（410型）和ZIPAX SPP色谱柱。并推出了第一批化学键合相，彻底改变了梯度HPLC的实践。岛津公司于同年开发出GPC系统，并于1972年与杜邦签订许可合同后开始制造销售LC-1（LC-830），1978年推出自主研制的LC-3A，以CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征。

3、进样阀的演变

当杜邦和Waters将新的SPP填料（37-50μm粒径范围）装入标准柱（内径2.1 mm，长度50或100 cm）时，背压适中，因此第一台商用液相色谱仪采用了在线GC隔垫进样器。

随着填料颗粒变小，隔垫进样器的耐压能力不足，促使停流（stop-flow）技术的出现。这种手动进样很麻烦，限制了样品的通量，因此Valco的创始人Stan Stearns调整了GC阀，使进样压力达到4500 psi。六通进样阀在生产率和重现性方面取得了真正的突破，并通过改变样品Loop定量环尺寸，使进样体积更灵活，还促进了后来进样器的自动化。

Waters在其集成LC系列中使用了六通进样阀后，1973年推出了自己的U6K进样器，可进行方便、可变体积和可靠的进样，并可实现自动化。该进样器还具有一个创新的旁路通道，可在阀门循环时降低压力冲击，从而保护色谱柱在重复进样后不会损坏。

后来，Rheodyne公司于1976年推出7125型进样阀，对Valco方法进行了改进，使进样器将样品注射入阀的中心，可使用单个Loop环实现可变的进样量。

4、模块的崛起

早期的许多色谱用户认为，每个制造商各有优势，因而希望将最好的泵与最好的进样器、最好的检测器等结合起来，目的是构建一个具有快速可互换（或可升级）模块的高级系统。为了满足这样的需求，一些制造商（尤其是OEM行业的制造商）决定开发可优化性能的独立模块。

其中第一家是实验室数据控制公司（Laboratory Data Control，LDC），该司还利用EmmettWatson的服务构建价格合理的独立模块，包括254 nm紫外检测器。该检测器成为多家色谱公司的主要OEM组件。规模更大的Milton Roy公司收购了LDC，并成为许多HPLC公司和个人色谱仪的模块供应商。Valco和Rheodyne等零部件公司专门生产注射阀（进样阀）和切换阀。Schoefel、Cecil Instruments和Pye Unicam等检测器公司开发了专门的探测器。许多较小的公司开发了其他外围设备，可以根据需要快速更换。

5、液相泵的发展

Waters紧随模块潮流，开发了一款名为M-6000的独立泵，这是第一款专门为HPLC开发的泵。M-6000使用了两个往复式活塞，以便更平稳地流向色谱柱。其6000 psi的额定压力足以满足20世纪70年代初引进的25 cm柱（内径4.6mm）中10微米粒径填料的要求。

Altex（后被贝克曼收购）开发了全新概念的泵，使用可变活塞速度和快速再充满（refill），由此产生的110型泵的流量比当时大多数低成本的往复式泵都要平稳。为了提供更高的压力和非脉动流量，瓦里安（后被安捷伦收购）、Isco和Nester-Faust（后被珀金埃尔默收购）选择开发注射泵。

在这里，大容量（250毫升）活塞由精确的步进电机驱动。这些泵基本上没有脉冲，可以耐受高达6000 psi的高压，后来达到8500 psi。对于二元梯度，需要两个注射泵。但由于溶剂体积可压缩性，色谱柱在梯度洗脱过程中遇到问题；进入混合器的每种溶剂的实际流量与控制器上的编程不同，这会产生成分错误——尤其是当每台泵的启动体积不同时。注射器泵虽然独特新颖，但最终消失了。然而，注射泵值得一提，因为这项新技术试图在提供无脉冲高压流量时跳出框框思维。

6、工业3.0时代

在20世纪60年代末和70年代初，主要的数据输出靠条形图记录仪。对于定量，通常采用手动方法，如切割和称重图纸或使用机械求积仪。Autolab改变了这一切，后来是SpectraPhysics（后被赛默飞收购又卖出，现属Newport）的一个部门，它推出了System IV计算积分器，提供数字读数。输出可以表示为简单的面积百分比或基于方法中存储的校准因子。由于其较大的动态范围，色谱仪不再需要在调整信号衰减的同时进行多次进样，从而提高了实验室生产率。

由微处理器控制的惠普HP 3380A积分器更进一步，它既是记录器又是字母数字打印机绘图仪，因此所有信息都在一张图表纸上。此后，许多制造商推出了自己的数据系统来补充HPLC硬件。1979年，Nelson Analytical开发了基于个人电脑的数据分析软件，利用新的大规模集成电路（LSI）构建模数转换器，并提供具有强大计算能力的仪器控制和数据采集，成为许多制造商系统中的标准。

在20世纪70年代中期，高效液相色谱法越来越多地被用于制药和其它行业，用户每天需要分析许多样品。第一台进入市场的HPLC自动进样器来自Micromeritics公司，这是一家专门从事粒度测量的公司，他们于1974年推出708A型LC自动进样器，使用旋转托盘中的管状小瓶。将一根针放入小瓶中，刺穿瓶盖，同时一个套环将瓶盖向下推入小瓶，将样品送入进样环中。该系统可对小瓶中进行1-3次取样。到20世纪70年代末，大多数主要供应商都推出了自己的自动进样器。

7、集成液相系统的回归

随着HPLC被广泛接受，仪器外围设备的中央控制更有意义。模块式LC概念正在失去支持，对于分析含有多种成分的样品，梯度洗脱是必须的。产生二元梯度的双泵系统（两个泵在高压侧垂直连接在一起，需要一个混合器）产生。

惠普的分析部门（现为安捷伦科技）改进了两年前收购的Hupe-Busch系统。HP 1084是第一款微处理器控制的LC，具有独特的流量控制功能，并配有自动进样器、紫外检测器和外部荧光检测器。1084的精确流量控制是很好的卖点，并具有高度可重复的保留时间。

由于两个泵产生梯度系统的成本很高，因此，使用两个或三个比例阀，可以生成二元或三元梯度，在方法开发过程中提供更大的灵活性。低压梯度最终成为许多公司的标准，后来还开发了更强大的四元泵。1978年，瓦里安推出的LC-5000是第一款集成的高效液相色谱系统，它将低压单泵梯度功能、关键功能的微处理器控制、用于设置方法的键盘和CRT显示器集成在一个单元中。主动式进样止回阀解决了止回阀粘性和注入损失的问题。1979年Spectra Physical推出的 Model 8000采用的设计与当今仪器中使用的溶剂混合设计几乎相同。

1975年，Dionex（后被赛默飞收购）作为DurrumInstruments的一个部门成立，以应对一个新兴的色谱市场：离子色谱（IC）。Dionex很快成为分离无机和有机离子化合物的领导者。他们的专利由陶氏化学公司授权，包括：使用离子抑制器从流动相中去除盐，对分离的离子进行电导检测。Dionex还开发了专门的IC柱，用于严格分离如饮用水中的痕量溴酸盐和卤代氧化物，使用脉冲安培检测器进行碳水化合物分离，以及离子排斥分离。

8、多种色谱检测器的问世

HPLC的前10年，光谱检测器占主导地位。采用DAD光电二极管阵列检测器后，可进行实时光谱测量，并可以实时获得完整的紫外-可见光谱，后成为行业标准。1977年，惠普推出了全球第一个DAD检测器8450，为此后的DAD检测器设定了黄金标准。随着GC-MS的巨大成功，各种液相色谱的接口类型被开发出来，以结合两种显然不兼容的技术——一种在液体环境中，另一种在真空中。接口技术包括直接液体接口、传输设备、粒子束、连续流FAB、离子喷雾和热喷雾。

第一个成功的LC-MS接口，使用的不是移动的金属丝，而是移动的传送带，可以传输更多的样本，以获得更好的灵敏度。1987年，Vestec公司推出热喷雾接口，热喷雾是20世纪90年代之前使用最多的LC-MS接口。

耶鲁大学的约翰•芬恩（John Fenn）开发了ESI电喷雾，可产生完整、高分子量、多重质子化或去质子化的离子。Jack Henion及其同事发了一种离子喷雾接口，使用雾化氮气辅助电喷雾操作；SCIEX（隶属于丹纳赫）使用了Henion专利，1989年推出第一款ESI类型的LC-MS接口。ESI现在是标准的LC-MS接口。

HPLC还发展了其它通用探测器。蒸发光散射检测器（ELSD）和带电气溶胶检测器（CAD）均将LC流动相流出物雾化成液滴，蒸发后留下非挥发性分析物的小颗粒。总的来说，2005年ESA Biosciences（先被Dionex收购，现隶属于赛默飞）推出的CAD检测器比ELSD更灵敏，并更利于梯度。CAD还可以检测所有非挥发性和许多半挥发性分析物，且响应一致。

9、超高效时代

20世纪80-90年代的大部分时间里，液相色谱仪大都使用3-3.5μm或5μm颗粒、6000 psi泵和4.6 mm内径的色谱柱。

为了满足快速分析的需要，研究者开发了亚2μm尺寸的填料，系统再次被推向更高的工作压力；而且由此产生的粘性加热效应需要更窄内径的色谱柱，因此还需要显著减少额外的色谱柱体积。2004年，Waters推出Acquity UPLC系统，满足了21世纪初新的小颗粒短柱（5-15 cm）和更窄孔径（内径2.0–2.1mm）的需求。Acquity对现有产品/技术进行了深思熟虑的组合，从而形成了一个具有合理低额外柱体积的实用系统。这项创新激励其它十几家公司推出类似的UHPLC产品。

10、其它创新

气泡让早期HPLC用户很烦恼，流动相中的气泡会损害主泵，检测器的流动池中也会有气泡。溶剂需脱气，首先将溶剂煮沸，再通过精心设计的储层将气体挡在外面。后来SpectraPhysics发现储液罐中的氦喷射阻止了空气在溶剂中的溶解，并允许低压混合有效地用于HPLC泵。再后来，膜脱气器取代了氦气喷射，成为今天所有HPLC/UHPLC的一部分。

Fittings（色谱接头）也令人头疼。通常情况下，过度拧紧配件会导致潜在泄漏，并在重新连接时表现不佳；来自不同公司的Fittings不兼容会产生死体积。Upchurch Scientific发明了手紧型接头（Fingertight fittings），易于重复使用，并耐受非常高的压力。

HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，应用十分广泛。其仪器结构和流程多种多样。典型的高效液相色谱仪结构和流程可用下列方框图表示(See Fig.3-4)。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除锈剂的分析等物质的分析。